磷酸化多肽操作步驟

磷酸化多肽操作步驟：

　　1.剪一適當(dāng)大小的硝酸纖維素膜并劃成25px大小的方格;

　　2.(磷酸化多肽)用緩沖液A浸濕膜并放于一用同樣緩沖液浸濕的濾紙上，使膜平坦;

　　3.用緩沖液B(含1mg/ml牛血清白蛋白)將樣品稀釋到合適的濃度，膜上每個點(diǎn)所加的樣品其激酶活性在0.5～50pmol單位(1pmol單位代表每分鐘轉(zhuǎn)移1pmol 32P的酶量)，當(dāng)酶比活性在1μmol/min·mg-1時則每個點(diǎn)應(yīng)加純酶0.5～50ng;

　　4.用微量加樣器加1～5μl樣品于膜上方格中央，待液滴消失后將膜面對含有緩沖液A(包括1～10mg/ml的底物)的Parafilm封口膜(貼于玻璃平板上)，在濕潤環(huán)境中23℃作用30分鐘。大片膜可密封于塑料袋中;

　　5.在100ml緩沖液A中洗膜并置于一新的Parafilm膜上(加有反應(yīng)混合物溶液25μl/cm2)，23℃作用5～30分鐘;

　　6.(磷酸化多肽)用緩沖液A 100ml洗膜4次，空氣干燥后進(jìn)行放射自顯影。或切成方塊進(jìn)行液閃計(jì)數(shù)定量。

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